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Phos-tag? Acrylamide

SDS-PAGE 分離不同磷酸化水平的蛋白！

　　在不使用放射性同位素的情況下，利用 Phos-tag? SDS-PAGE 即可分離不同條帶中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分離后的凝膠可用于 Western blotting 和質譜分析等后續實驗。

　　Phos-tag? SDS-PAGE 操作簡單，只需在常規 SDS-PAGE 膠中加入 Phos-tag? Acrylamide 和 Mn²⁺ 或者 Zn²⁺ 即可進行實驗。在電泳過程中，磷酸化蛋白的磷酸基團與 Phos-tag? 中的二價金屬離子相結合，降低其遷移速度，從而可區分磷酸化與非磷酸化蛋白。

◆原理

◆優點、特色

●  采用 Phos-tag? SDS-PAGE 可輕松分離磷酸化蛋白

　  無任何放射性元素及化學標記！

●  可檢測不同磷酸化水平的磷酸化蛋白

　  無需任何磷酸化抗體！

●  適用于內源性蛋白的磷酸化分析！

◆案例、應用

【使用Phos-tag? SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比較】

我推薦使用Phos-tag ? ——東京大學研究院醫學研究科 小川覺之

　　Phos-tag ? 是專為研究磷酸化蛋白而新開發出來的試劑。此產品使用方便，不但可用于體外實驗，還能定量分析體內蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ? SDS-PAGE 可用于常規電泳實驗，無需購買特殊設備，性價比高。傳統蛋白磷酸化的研究需要特異的磷酸化抗體、RI 等其它試劑，操作復雜，花費大，且放射性元素會有安全隱患，而 Phos-tag ? 的出現恰恰可以彌補這些缺點，為磷酸化蛋白研究提供新的方向。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ? SDS-PAGE 的分離效果圖

　　Lane 1 為非磷酸化蛋白，Lane 2-5 為磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化狀態不同而條帶遷移率也有所不同。

　　磷酸化/ 非磷酸化蛋白的數量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的豐度等都可根據條帶遷移和條帶濃度求得。

【資料提供】

日本東京大學研究生院醫學系研究科

【二維電泳中的應用：分析 hnRNP K 磷酸化異構體】

　　小鼠巨噬細胞 J774.1 經 LPS 刺激后，裂解細胞，經過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K 。在二維電泳中，一維是IPG 膠，二維是 Phos-tag ? SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構體。利用質譜儀，可以確認不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。

二維電泳

　　同一個等電點的位置上，不同位點發生磷酸化都可以被區分開來（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【參考文獻】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【結果提供】

　　橫濱市立大學 生命納米系統科學研究科 生物體超分子系統科學專業 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化學研究所 RCAI 小原收

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的變化】

　　常規 SDS-PAGE 和Phos-tag^TM SDS-PAGE 后迚行克疫印跡實驗分析 EGF 刺激的 A431 細胞中 MAPK 磷酸化水平。

摘自 Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

◆相關產品

phos-tag? 由日本廣島大學研究生院醫齒藥學綜合研究科醫藥分子功能科學研究室開發，對應指導手冊請見相關資料。